单细胞数据分析大概方向，但是还是备份下
更多其实是看文章，文章大致方向的套路差不多，更多是做聚类，然后再各类的基础上再亚聚类；找出各类对应的细胞类型；后面的于功能结合的分析才是重点部分
个人理解：
肿瘤单细胞测序，与普通样本测序分析最大的区别在于这里一个细胞就是一个样本，普通的就是很多个细胞一起；因为每一个细胞的基因表达都是不一样的，而普通的一堆细胞放在一起测序就看不出各个细胞之间的差别；所以肿瘤单细胞测序的基本分析目标就是为了看肿瘤的异质性，发现新的亚型。
分析思路大体是获取到各个样本的表达量，对各个样本聚类，比如层次聚类和K-means;
从而分出新的亚型；然后就寻找在各个类别中的差异基因；知道哪些基因在哪个类中高表达或者低表达；而单细胞测序分析特别的一点在于降维不使用PCA，而是使用t-SNE，这是因为PCA是线性降维而t-SNE是非线性的，这样更好反映样本之间的关系；
了解单细胞测序原理：
推荐看陈魏学基因：
爱奇艺链接：http://www.iqiyi.com/w_19rsbneilx.html?list=19rrmo2s4q
由于目前很多人使用10Xgenomic这个其中一种单细胞测序方法，所以主要是使用10X genomic作为例子；
10Xgenomic介绍
视频版本：
http://v.youku.com/v_show/id_XMjk4MDU0NDg0OA==.html?spm=a2hzp.8253869.0.0
单细胞测序方法的一种；
准备细胞悬液——文库构建——转录组测序——数据分析——可视化
凝胶微珠,每个凝胶微珠上有特定的DNA片段、每个DNA序列分了一下几段：第一段是Barcode。16个碱基长度、总400万种、一个微珠对应一种Barcode，通过400万种可以把凝胶微珠区分开；
第二段是UMI，unique molecular identifier，独特分子标记物、UMI是一段随机序列、每一个DNA分子都有自己的UM序列、10个碱基长的UMI,UMI的作用是经过PCR、深度测序得到的reads后，可以知道哪些reads来源于一个原始的cDNA分子的；
Poly(dT)序列：与mRNA的Poly(A)尾巴结合 、引物，逆转录出cDNA
总之，Barcode是每个凝胶微珠身份证号码；UMI是每个DNA标签分子的身份证号码。
左边是准备好的凝胶微珠，细胞混悬液在第一个十字交叉口与凝胶微珠混合在一起、然后进入第二个十字交叉口，加入了油相，油把凝胶微珠和细胞混悬液包裹成一个个油包水的小液滴； 里面是水相，外面是油相；在这些乳浊液小液滴中，大部分是包含了一个细胞的；
得到乳浊液之后，破裂细胞膜，让细胞中的mRNA游离出来；游离出来的mRNA在小液滴中 水相中会和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触；从而发生逆转录反应； 得到的cDNA分子带有凝胶微珠所特有的Barcode标签，并且每一个cDNA 分子各自还带有特定的UMI标签；从而将不同细胞和同一个细胞不同的cDNA分子区分开来。
抽出水相中的cDNA 分子、然后加上接头P5,P7,经过PCR扩增、做成illumina测序文库、
然后前面的方法上机测序。
通过Barcode拆分细胞，把测序得到的reads归属到一个一个细胞，有少量会有两个或者更多的细胞共享一个barcode，制备混合液的时候，控制细胞数，数目越少混合越少；
通过UMI 对Reads进行简并；可知一个细胞被读到基因数目；
一个基因对应同一个UMI,基因表达量的mRNA越多，这种UMI数目越多， 从而得知这个基因的 表达量；
下图是显示出人类和小鼠两个不同物种样本放在一起测序，看混合的数目，这可以看出测序质量好坏，中间部分混合越多，说明两个细胞共用了一个barcode；
数据分析部分：
10X的官方教程：
第一个是通过cellranger：
这个他们自己开发的集成很多功能的软件：对原始测序bcl2格式的数据转换成fastq格式的文件、比对、过滤、UMI计数、归一化、降维（PCA、tSNE）、聚类（k-means）和差异表达分析等。由于集成度很高，所以代码很简单。得到结果会通过html页面显示。结果文件的矩阵不是普通的表达矩阵，而是使用了稀疏矩阵格式储存的。这样可以节省非常大的空间。
R包：Seurat、cellrangerRkit：
质量检查、标准化、检测单细胞可变基因、PCA和tSNE降维、聚类、绘制热图。更加细致分析。
第一步结果：HTML文件会显示出细胞数目、每个细胞总read平均数、平均基因数等统计信息；每个细胞UMI数目绘制t-SNE图：UMI数目多的有更高的RNA数目；以及通过K-means聚类结果并显示对应的t-SNE图和对应的差异表达分析；
非官方教程：
目前单细胞分析有三大R包：分别是Seurat、monocle2、scater：
生信技能树作者都有写过教程：
Seurat：https://mp.weixin.qq.com/s/QZD1tvCgZVa5PQtbjvrkrg
monocle2：https://mp.weixin.qq.com/s/zCfDkxbVTxjFQ5QAIULYjA
scater :https://mp.weixin.qq.com/s/mcLEiL2k2ABXNBzipy1WHQ
生信技能树新开专门讲单细胞的公众号：单细胞天地，微信号：sc-ngs，查看历史记录；
单细胞相关文献：链接：https://pan.baidu.com/s/10F-3S3VlmQ3WG0OSvHyfeQ 密码：0caf
知识星球：“单细胞”；有很多分享的资料：